1. 胶回收pT2 分五段重组的DNA片段

2. 测试现有Spcas9的人的二代引物退火温度，用H9酶

   所有引物均可以用65℃，SJ2cx-141、142、143、144无条带

3. gibson pT-1，pT-2。转化涂板。

4. 金唯智返样：pT3-1—408；397-1、397-2；389-1、389-2；423-3；pT4-2—pT3；408-2、408-3—pT4

所需试剂：0.05 T胰酶，0.1 T胰酶，含2.5%或10% FBS的MEF，PBS，DMEM。

快速准备法（293T）：

1. 弃去培养基，加入PBS涮洗三下，弃去PBS。

2. 加入0.1T 胰酶，孵育10s，弃去胰酶。

3. 静置1 min，同时敲打培养皿，待细胞全脱落了，加入100 uL 含2.5% FBS的MEF。

所需试剂：限制性内切酶，对应缓冲液，质粒，水。

一种内切酶体系如下：

    质粒            3 ug

    内切酶        10 IU

所需试剂：P1、P2、P3、70%~80%乙醇水溶液和异丙醇。

1. 1 mL LB培养基接菌，摇至浑浊，约8h。

2. （可选）保菌50 uL。
   

3. 12000g离心10s，弃去上清。

4. 加入50 uL P1，涡旋振荡至沉淀消失。

适用于构建质粒初步验证。

1. 选择合适的PCR引物，要求一条引物在骨架上，一条引物在插入片段上（或者两条引物在骨架上，且位于插入位置两侧）。

2. 配置PCR体系（10 uL）

3. 准备同样数量的两组PCR管，一组加入PCR混合液，一组加入100 uL LB培养基

4. PCR30个循环，退火温度和延伸时间依据插入片段设定。

胶回收：

1. 切下目的条带，置于2 mL管，加入300 uL GDP（漫过胶块）。

2. 置于60℃溶胶胶。

3. 加入0.7倍液体体积的异丙醇。混匀，静置1 min。

适用于：获取细胞转染级的质粒

1. 提取前一天，15 mL培养基接菌。至提取时，摇菌12 h~16 h。

2. 5000 rpm离心5 min，弃去上清液。5000 rpm离心1 min，用枪吸弃上清液。

3. 500 uL S1重悬菌体沉淀，转移至2 mL管。37℃静置10 min。

试剂：omega提供的S1、S2、N3和去内毒素试剂

异丙醇法：

适用场景：通常用于

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