异丙醇法:
适用场景:通常用于大体积样本(如质粒大抽)或需要快速操作的场景。
添加盐离子: 加入1/10液体体积3 M NaAc。
加入异丙醇: 加入 0.6 至 0.7 倍体积的室温异丙醇。
沉淀: 充分颠倒混匀。异丙醇沉淀通常在室温下进行即可,因为低温反而容易导致盐类大量析出。
离心: 4°C 下,12000g离心 10 分钟。注意:异丙醇形成的沉淀通常是透明胶状的,比乙醇沉淀更难观察。
弃废液: 小心吸走上清。
洗涤(关键步骤): 加入 管一半体积的 70% 乙醇。这一步非常关键,因为 70% 乙醇可以置换掉沉淀中的异丙醇并洗去析出的盐分。4°C 下,12000g离心 5分钟。小心吸走上清。
空离:12000 g离心10s。
干燥:弃去上清,开盖空气干燥 5 分钟。
复溶: 加入适量 TE 缓冲液或无菌超纯水溶解。
乙醇法:
适用场景:乙醇沉淀最为常用,尤其在需要高纯度 DNA(如测序、酶切)时。
添加盐离子: 向 DNA 溶液中加入 1/10 体积的 3 M 乙酸钠 (NaAc, pH 5.2)。确保充分混匀。
加入乙醇: 加入 2 至 2.5 倍体积的冰冷无水乙醇。
沉淀: 充分颠倒混匀。为了提高回收率,通常建议在 -20°C 放置 30 分钟以上(或者 -80°C 放置 15 分钟)。注意:如果 DNA 浓度极低,可延长至过夜。
离心: 在 4°C 下,以12,000 g离心 15 分钟。
弃废液: 小心弃去上清液,避免触碰管底的白色沉淀(Pellet)。
洗涤:加入 管一半体积的 70% 乙醇,轻飘沉淀(无需重悬),再次4°C离心 5 分钟。
空离:12000 g离心10s。
干燥:弃去上清,开盖空气干燥 5 分钟(至酒精味消失,但不要让沉淀完全干透成透明状,否则极难复溶)。
复溶: 加入适量 TE 缓冲液或无菌超纯水溶解。
PS:
① 使用3M乙酸钠,残留的钾离子可能影响后续反应(如PCR),适用于电转感受态前的DNA纯化、质粒提取,但禁用含SDS的裂解液纯化DNA;使用NaCl,可能残留大量盐分,适用于一般DNA纯化,但电转感受态禁用。
② 异丙醇提取的DNA没有乙醇提取的纯度高,优先乙醇提取,但是如果需要快速提取,用异丙醇。