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无内毒素沉淀法提取质粒

jiong jiong 发表于2026-04-06 13:38:00 浏览15 评论0

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试剂:omega提供的S1、S2、N3和去内毒素试剂

  1. 预冷离心机到4℃

  2. 1 mL菌液RT 12000g 1 min,弃去培养基。RT 静置10 min。

  3. 加入250 uL S1重悬菌块。

  4. 加入250 uL S2,轻柔颠倒7次,静置1 min。等待过程中打冰。

  5. 加入125 uL 预冷N3,颠倒21次,4℃ 13000g 10 min。

  6. 准备1.5 mL,加入62.5 uL ETR,至于冰上。

  7. 将4离心后上清倒入5的1.5 mL管中。颠倒混匀,置于冰上10 min。期间多次混匀。

  8. 将金属浴预热至42℃,将6中的1.5 mL管置于金属浴上5 min。

  9. RT 13000g 3 min。

  10. 小心吸取上清转移至新的1.5 mL管,加入0.6倍异丙醇(375 uL),颠倒混匀,静置10 min。

  11. 4℃ 13000g 5 min。小心倒出上清。

  12. 加入1 mL的70~75%乙醇,涮洗管壁,4℃ 13000g 5 min,小心吸弃上清,可见白色沉淀。

  13. 重复11。

  14. RT晾干5 min,加入55℃预热EB 30 uL。涡旋,RT 13000g 1 min。

  15. 测浓度。

 

PS:

  1. 步骤9换成乙醇沉淀法(加入2.5 M NaCl或3 M NaAc)会造成浓度虚高。

  2. 30 uL EB 溶解,可获得约500 ng/uL 质粒浓度(总质粒量15 mg)