jiong的科研记录

[260413]科研记录

Mon, 13 Apr 2026 13:55:34 +0800

今日事

对不同GFP变体进行规整。发现PJ395和PJ396有问题，需要重新构建。
复苏Bama31-7 P41管，1：2复苏两孔6孔板孔。

流式相关

Fri, 10 Apr 2026 10:53:51 +0800

用PBS当回收液，PCR结果优于DMEM。
细胞裂解液，每5000个细胞加5 uL，5000个细胞以下加5 uL。
5000个细胞及以上的粗裂解产物，第一轮反应1 uL当模板即可；如果是用EB稀释了1倍，第一轮反应2 uL当模板。
500-5000个细胞需要2 uL作为第一轮反应模板；如果是用EB稀释了1倍，第一轮反应2 uL当模板。

[260409]科研记录

Thu, 09 Apr 2026 20:24:50 +0800

今日事

过流式（PFF 0408转染），铺板
PCR pT6片段
测试流式细胞5000，10000，15000粗裂解产物一轮PCR结果
胶回收pT7、pT8和pT9片段
送库2026a2
送纳米孔流式169~183、WT101、WT103和WT104

二代测序引物设计

Tue, 07 Apr 2026 22:24:02 +0800

PE150双端测序：测序一次150 bp

上游测序：23（上游通用接头）+ 127

下游测序：130 + 20（下游通用接头）

重叠部分：20 - 50 bp，建议30 - 50 bp

从基因组上PCR：207 - 227 bp（不加通用接头的时候）

加上接头：250 - 270 bp

第一次跑胶大小在200 - 300 bp

第二次PCR：386 - 406 bp

第二次跑胶大小在300 -400 bp

NCBI primer-blast 范围434 bp，从sgRNA5'端往上拉207，再往下拉434 bp，prime大小在207-227之间，sgRNA得在中间位置被包含

脂质体转染常见用量

Tue, 07 Apr 2026 22:22:52 +0800

[20260408]科研记录

Tue, 07 Apr 2026 22:18:40 +0800

今日事

PCR 402-全。
gibson PJ402，pT3。转化涂板。
建库2026a2
电转PFF
菌P pT1和pT2，送测序

二代测序自建库

Tue, 07 Apr 2026 21:42:09 +0800

所需试剂：H9酶。

第一次PCR体系如下：

H9 mix: 10 uL

F: 0.8 uL

R: 0.8 uL

template 2 uL

ddH₂O 6.4 uL

程序：

94℃ 3min; 94℃ 25s, 65℃ 25s, 72℃ 5s/ 30 cycles; 72℃ 5min, 12℃ ∞

第二次PCR体系如下：

H9 mix: 10 uL

primer 0.9 uL

template 1 uL

ddH₂O 8.1 uL

程序：

94℃ 3min; 94℃ 25s, 55℃ 25s, 72℃ 5s/ 8 cycles；94℃ 25s, 65℃ 25s, 72℃ 5s/ 8 cycles; 72℃ 5min, 12℃ ∞

PS：

退火温度需要提前测试。建库最后一步回收时，每孔取3 uL，条带浅的适量增加。

[20260407]科研记录

Tue, 07 Apr 2026 09:56:03 +0800

胶回收pT2 分五段重组的DNA片段
测试现有Spcas9的人的二代引物退火温度，用H9酶
所有引物均可以用65℃，SJ2cx-141、142、143、144无条带
gibson pT-1，pT-2。转化涂板。
金唯智返样：pT3-1—408；397-1、397-2；389-1、389-2；423-3；pT4-2—pT3；408-2、408-3—pT4
胶回收402-上和402-下片段。

流式准备

Mon, 06 Apr 2026 16:59:08 +0800

所需试剂：0.05 T胰酶，0.1 T胰酶，含2.5%或10% FBS的MEF，PBS，DMEM。

快速准备法（293T）：

弃去培养基，加入PBS涮洗三下，弃去PBS。
加入0.1T 胰酶，孵育10s，弃去胰酶。
静置1 min，同时敲打培养皿，待细胞全脱落了，加入100 uL 含2.5% FBS的MEF。
吹打，转移至流式管。
准备回收管，每管200 uL PBS。

一般准备法：

弃去培养基，加入PBS涮洗三下，弃去PBS。
加入适量0.1T （0.05 T）胰酶，37℃孵育2 min。
敲打培养皿，待细胞全脱落了，加入适量含10% FBS的MEF。
吹打，转移至1.5 mL离心管，4000 rpm离心 20s。
弃去上清，每管加入70 uL DMEM。
转移至流式管。
准备回收管，每管200 uL PBS。

酶切

Mon, 06 Apr 2026 16:50:32 +0800

所需试剂：限制性内切酶，对应缓冲液，质粒，水。

一种内切酶体系如下：

质粒 3 ug

内切酶 10 IU

10x缓冲液 5 uL

ddH₂O 补足至50 uL

37℃酶切1 h（如果是快切酶且最适温度是37℃的话），否则过夜。

两种内切酶体系如下：

质粒 3 ug

内切酶 10 IU

10x缓冲液 5 uL

ddH₂O 补足至50 uL

37℃酶切1 h（如果是快切酶且最适温度是37℃的话），否则过夜。

PS：

酶切过后还需要80℃灭活30 min。